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慢病毒包裝:從基本概念、原理和步驟說起

文字:[大][中][小] 手機頁面二維碼 2019/8/20     瀏覽次數:    

說起慢病毒包裝,我們首先需要知道慢病毒( Lentivirus )載體,這是以 HIV-1 (人類免疫缺陷 I 型病毒)為基礎發展起來的基因治療載體,對分裂細胞和非分裂細胞均具有感染能力。目前被廣泛地應用于表達RNAi的研究中。

由于有些類型細胞脂質體轉染效果差,轉移到細胞內的siRNA半衰期短,通常體外合成 siRNA 對基因表達的抑制作用通常是3~5天,因而使其應用受到較大的限制。

然而,通過慢病毒包裝能夠產生表達shRNA的高滴度的慢病毒,在周期性和非周期性細胞、干細胞、受精卵以及分化的后代細胞中表達 shRNA,實現在多種類型的細胞和轉基因小鼠中特異而穩定的基因表達的功能性沉默,為在原代的人和動物細胞組織中快速而高效地研究基因功能,以及產生特定基因表達降低的動物提供了可能性。



siRNA轉染
shRNA質粒轉染
shRNA慢病毒病毒感染細胞
特點

發揮時間短,僅3-5天,當siRNA消耗完后便失去敲減效果

有效時間7-10天左右,當細胞不斷分裂后,質粒逐漸減少,敲減效果逐漸降低

10天以上,如果用藥物篩選出穩轉株,可以永久使用

優點

序列短,轉染效率高,成本較低

因為質粒帶的shRNA能不斷表達出siRNA,敲減時間較長

轉染效率非常高,不用轉染試劑,可直接加入細胞里,操作方便。有效時間長,可做永久敲除。

缺點

短期做敲除,有效時間短

質粒本身較大,影響轉染效率,成本略高

病毒本身對細胞有點毒性,病毒量過大會導致細胞死亡。一般成本挺高。

慢病毒包裝原理

慢病毒表達載體包含了包裝、轉染、穩定整合所需要的遺傳信息。慢病毒包裝質粒可提供所有的轉錄并包裝shRNA到重組的假病毒載體所需要的所有輔助蛋白。為產生高滴度的病毒顆粒,需要利用表達載體和包裝質粒同時共轉染細胞,在細胞中進行病毒的包裝,包裝好的假病毒顆粒分泌到細胞外的培養基中,離心取得上清液后,可以直接用于宿主細胞的感染,目的基因進入到宿主細胞之后,經過反轉錄,整合到基因組,從而高水平的表達效應分子。

慢病毒包裝原理示意圖


裝步驟

(一)準備階段

1.構建含有目的基因的病毒載體。

2.指數生長的293T細胞;

3.病毒包裝質粒Mix=pMDL:VSVG:REV=5:3:2,不同載體系統所用的包裝病毒質粒也不一樣,此系統可用于包裝PLKO,Plv等載體質粒。

4.轉染試劑:lipo2000。


(二)簡要實驗步驟(詳細的慢病毒包裝步驟要點請看:慢病毒包裝步驟詳細教程

1.細胞分盤:通過胰酶消化收集細胞,將細胞種于60mm培養皿(根據實驗需求)。將細胞置于含5%CO2的37℃溫箱中孵育8-24h,當細胞貼壁后所占面積達到培養皿總面積的50%以上時進行轉染。

2.混勻核心質粒和包裝質粒:取兩個無菌1.5ml EP管,一個EP管中加入200μl無血清DMEM,加入1.5μg核心質粒和1.5μg病毒包裝質粒;另一個EP管中加入200μl無血清DMEM,加入6μl lipo2000,靜止5分鐘。然后將兩管充分混勻,靜置15-20min。

3.孵育:將這400μl的混合液逐滴加入細胞培養皿中,輕輕搖動平皿混勻后置于含5%CO2的37℃溫箱孵育。

4.換液:10h-16h后吸去培養基,加入適量37℃預熱的完全培養基,繼續將細胞放置溫箱孵育。

5.收集病毒上清:轉染后24h、48h左右收集含慢病毒的上清。1500rpm離心五分鐘,或者使用0.45um濾器過濾后分裝凍存于-80℃。避免反復凍融。

6.病毒感染:將細胞平鋪于35mm培養皿,12-24h后換液,最佳密度為30%-50%。加入收集的病毒上清液培養。細胞長滿后傳代或者檢測表達。

慢病毒包裝步驟流程圖

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