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慢病毒包裝技巧:如何獲得高滴度慢病毒?

文字:[大][中][小] 手機頁面二維碼 2019/8/21     瀏覽次數:    
病毒是強大的介導外源基因表達的工具,可在體內和體外實現過表達、基因沉默、基因編輯等多種應用,讓我們的研究變得更加便利。然而對于剛接觸包裝慢病毒實驗的新手來說包裝出高滴度的慢病毒可能會比較復雜。本文則詳細的講解了通過慢病毒包裝獲得高滴度慢病毒的關鍵,希望對各位的實驗有幫助。

獲得高滴度慢病毒的關鍵
1.包裝細胞

細胞的健康狀態是影響病毒產量的最關鍵因素。因此,我們一般我們選擇293T細胞(穩定表達Large T antigen大T抗原版本)作為包裝宿主。


用于慢病毒包裝的293T細胞的傳代數不宜過高。當我們從ATCC或其他正規細胞庫購得細胞后,將復蘇并培養的那一代記為第1代(暫時不管之前ATCC到底傳了多少代)。在擴增培養、凍存及后續復蘇使用時,務必記錄傳代數。在我手里用于包裝慢病毒的293T,通常都在第6代左右,到第15代包裝出來滴度并未有顯著下降,但并沒有測試過更高的代數。


第二是培養條件。293T細胞增殖飛快,營養消耗速率不低,因此保證培養基的養分充足也是個關鍵因素。通常使用高糖DMEM(含丙酮酸鈉版本,多一些碳源)+10% FBS即可滿足需求。但是,DMEM中的Glutamine并不穩定,在4℃保存和37℃水浴、培養的條件下會自發降解,因此推薦在上述培養基中添加GlutaMAX。

2.轉染
高效率的轉染也是保證高滴度的關鍵。不過在此有必要敲一下黑板:在考慮轉染條件時,不光要看轉染效率,還得看細胞毒性。事實上,293系列的細胞都極易轉染,效率隨隨便便就破90%以上。因此,在包裝慢病毒的轉染實驗中,我們應該更多地去關注毒性問題。正因如此,有不少方案甚至推薦使用鈣磷轉染法或PEI(聚乙烯亞胺)轉染法。當然,在個人的經驗中,并不需要做得如此極端。只要使用相對溫和的試劑,并在轉染后早些換液,即可避免毒性問題。

3.Transfer Plasmid的大小

這里我們定義,那個包含我們要表達的外源基因的質粒為transfer plasmid。大家應該已經清楚,transfer plasmid容納外源基因長度的能力是有限的。盡管理論上,在LTR之間可以插入的基因長度約為8.5 kb,但超過3 kb就會導致包裝效率降低。而整個質粒過大,也會導致轉染效率降低,進而影響最后的滴度。插入片段的大小,是我們不能控制的,但我們可以盡量選擇較小的transfer plasmid骨架(如無必要,不要攜帶其他元件如GFP等)。

Transfer Plasmid的基本結構


4.Packaging Plasmid中的Tat

包裝慢病毒,除了transfer plasmid之外,我們還需要envelope plasmid和packaging plasmid。對于Envelope plasmid,通常我們選擇VSV-G,因為含有這個包膜蛋白的慢病毒可以感染多種宿主。而packaging plasmid的基本構成為Gag,Pol,Rev和Tat。每一個組件的功能,可以在本文最后的附錄表格中查到,但現在先來重點看一下Tat。

Packaging Plasmid的基本結構

慢病毒是一種血源性病原體(要知道,人類免疫缺陷病毒,即HIV也是一類慢病毒)。為了將其改造成實驗工具,科學家將慢病毒的包裝和表達組件減少到最低程度。目前我們所能接觸到的實驗用慢病毒,由于至少需要3個質粒才能生產出來(即第二代慢病毒系統),因此成品慢病毒都不再具備生產子代病毒的能力。而為了進一步提高安全性,怕萬一不小心真的見鬼了(即使幾率低到不可思議),目前還有第三代慢病毒系統。它除了將packaging plasmid拆成幾個之外,還對5’-LTR進行改造,從而進一步拋棄了Tat組件。


然而,拋棄Tat組件是有代價的。即使采用了嵌合LTR的第三代transfer plasmid,一旦缺少了Tat,同樣會導致滴度降低。具體請看這篇文章的數據(也就是創造第三代慢病毒的文章):其中pHR2是第二代質粒,在無Tat的情況下,滴度降低了一個數量級。而即使使用了第三代的pRRL質粒,缺少了Tat,滴度依然顯著降低(雖然滴度近5 Million/ml,已經是非常高的了)。


因此,綜合考慮安全性和滴度,我們可以采用分體的packaging plasmid,但額外加入表達Tat的質粒。

5.病毒穩定性

和其他生物制品一般,保證慢病毒的穩定性也是至關重要的因素。慢病毒是在37℃細胞培養環境中包裝的。根據現有的認識,慢病毒在37℃溶液的半衰期不超過12小時,甚至有文獻報道僅有6小時左右。由此可見,我們有必要從延長半衰期入手。


目前通常認為,常用的VSV-G包膜慢病毒對pH極為敏感。當pH低于7.0時,感染能力會逐步下降。盡管有另外的觀點認為,pH 6.0反而有助于提高病毒滴度,但實際效果相當有限。再加上弱酸性環境,會給我們的細胞培養及后續使用病毒帶來一些潛在的麻煩,因此這里依然建議將pH維持在7.2較為妥當。前面提到,293T是增殖極為迅速的細胞。這類細胞有一個共同的特點,即糖酵解代謝速率極高,會產生大量的乳酸,迅速酸化培養基(表觀上看,培養基會很快變黃)。據此,我們可以額外加入10-15 mM HEPES增強DMEM培養基的pH緩沖能力。
脂類和蛋白質是常用的生物制品穩定劑。下面這篇文獻的結果顯示,對純化的慢病毒來說,加入脂蛋白和人血清白蛋白有助于延長半衰期。 

與此同時,Broad Institute的The RNAi Consortium的方案也顯示,使用30% FBS或者額外添加終濃度1%的BSA,能夠顯著提高病毒滴度。從經濟的角度而言,對于慢病毒粗制品,我們完全可以選擇BSA方案,因為粗制品中已經含有攜帶脂類的FBS,我們只需提高整體蛋白濃度。


盡管如此,慢病毒在37℃溶液的半衰期依然無法大幅度超過12小時。然而我們并不需要感到悲觀,因這是一個生產和降解相互博弈的過程。只要包裝生產的速度,遠超過降解的速度,就可以保證獲得高滴度的病毒。一般認為,在轉染后的第24-48小時之間,是慢病毒的生產高峰。這時我們可以收獲第一批慢病毒,此時也是滴度最高的時候。在隨后的48-72小時中,包裝依然持續進行,但滴度下降(生產能力下降,但降解速率不變)。從產量角度而言,在這24小時內,我們可以使用小體積的培養基收獲1-2次慢病毒,并和第一次的合并。而如果單純追求高滴度,收獲一次即可。事實上,第一次收獲的慢病毒,已經可以滿足多次實驗的需求了。


附錄

來源https://www.addgene.org/viral-vectors/lentivirus/lenti-guide/


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