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慢病毒滴度的檢測方法

文字:[大][中][小] 手機頁面二維碼 2019/8/22     瀏覽次數:    

慢病毒滴度值是用于評估轉導一定數量靶細胞所需要的病毒數量,所謂病毒滴度即每升溶液中含有的病毒數量。轉導單位(TU)即能夠感染并整合到細胞內的病毒載體基因組。常規生產的病毒的滴度在2 x 10E8TU/ml之間。

下面我們就來聊下幾種常見的慢病毒載體滴度的檢測方法。傳統的慢病毒包裝效率檢測方法有ELISA法(檢測P24蛋白)和Real-time PCR法(檢測核酸拷貝數),最近又有了基于膠體金層析技術的半定量檢測卡。我們一一介紹。



ELISA法檢測病毒滴度
當通過純化獲得重組慢病毒顆粒后,需要對慢病毒液的濃度或感染活性進行定量檢測。一般來說,對于病毒顆粒進行定量主要是通過檢測純化的病毒液中DNA的OD260來檢測其病毒含量(Quantitation);而對于病毒顆粒的滴度檢測(Titer),則需要通過傳統的克隆成斑試驗或者對病毒特異蛋白的免疫反應試驗等檢測,如:慢病毒外殼蛋白p24的免疫學ELISA方案。p24蛋白是慢病毒外殼中含量最大的標志性蛋白。基于慢病毒p24蛋白的ELISA分析分兩種,一種稱為傳統的p24蛋白ELISA檢測(Quantitation Kit (Traditional HIV p24 ELISA)),能檢測所有p24蛋白,從而實現對病毒滴度的定量。分為一次96孔板分析和五次96孔板分析,采用ELISA方法,反應靈敏,可檢測1 ng/mL HIV p24蛋白,最后分光光度計讀取數據。由于病毒顆粒的外殼蛋白p24蛋白是由包裝細胞系提供的,因此在使用檢測的時候不可避免的會將病毒顆粒本身的p24蛋白與包裝細胞系產生的p24蛋白一起檢測,造成實驗的誤差,而較新的Lentivirus Titer Kit(Lentivirus-Associated HIV p24)能分離出包裝細胞產生的游離p24蛋白,只檢測病毒顆粒表面的p24,因此實驗數據更真實準確。分為一次96孔板分析和五次96孔板分析,采用ELISA方法,反應靈敏,可檢測1 ng /mL HIV p24蛋白,最后分光光度計讀取數據。

Real-time PCR法檢測病毒滴度
慢病毒感染靶細胞的感染效率可以通過Real-time PCR檢測靶細胞中的慢病毒載體拷貝數來測算。所謂Real-Time PCR技術,是指在PCR反應體系中加入熒光基團,利用熒光信號累積實時監測整個PCR進程,最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。利用熒光信號的變化實時檢測PCR擴增反應中每一個循環擴增產物量的變化,通過Ct值和標準曲線的分析對起始模板進行定量分析。real-time PCR技術即實時熒光定量PCR避免了傳統PCR以終產物監測定量產生的偏差,提高實驗的重復性。該技術已經被廣泛用于監測細胞mRNA表達量的變化;比較不同組織的mRNA表達差異;驗證基因芯片,siRNA干擾的實驗結果。

膠體金檢測卡檢測病毒滴度
基于膠體金層析技術的慢病毒載體滴度半定量快速檢測卡可用于慢病毒載體和假病毒包裝效率的快速評估。在一定的檢測范圍內,檢測線顏色的深淺與P24濃度呈正相關,通過比色卡比較,可以半定量待檢樣品中P24濃度,并大致估算慢病毒滴度。



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