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實驗技術交流

細胞劃痕實驗步驟及技巧

文字:[大][中][小] 手機頁面二維碼 2019/8/26     瀏覽次數:    
細胞劃痕實驗是一種非常簡單的檢測細胞運動的方法,本文主要介紹細胞劃痕實驗的步驟方法和相關技巧。


細胞劃痕實驗步驟:

1.實驗材料:細胞樣品、直尺、marker筆、6孔板、顯微鏡、酒精燈、移液槍、CO2培養箱等;PBS等。

2.實驗準備階段:將所有實驗器械進行滅菌處理,將直尺和marker筆放超凈臺內,用紫外照射30min

3.實驗操作:

a) 用marker筆和直尺在6孔板背后均勻的畫橫線,大約每隔0.5-1cm一道,橫穿過孔,每孔至少穿過5條線。

b) 在孔中加入約5*105個細胞,具體數量因細胞不同而不同,掌握為過夜能鋪滿。

c) 第二天用槍頭比著直尺,盡量垂至于背后的橫線劃痕,槍頭要垂直,不能傾斜

d) 用PBS洗細胞3次,去處劃下的細胞,加入無血清培養基。

e) 放入37℃,5%CO2培養箱,培養。通過顯微鏡拍照。


實驗技巧總結:

1) 在用PBS緩沖液沖洗時,應當貼壁勻速緩慢加入,這樣做的目的是避免單層貼壁細胞被沖散,影響劃痕實驗拍照結果

2) 推薦使用6孔板鋪細胞,因為6空板可以保證有相當距離的平直劃痕,而且因為有5條定位線,與劃痕相交,這樣就有10個可固定監測點,不作重復,誤差也很小。

3) 劃痕實驗應當選擇無血清或者低血清(<2%)否則細胞增殖就不能忽略。

4) 實驗時應注意細胞生長狀況,選擇適當的細胞接種濃度。對不同的細胞要觀察細胞的貼壁率等,確定實驗時細胞的接種數量和培養時間,保證培養終止時密度適當。

5) 如果你連續監測24小時,你需要考慮到劃痕縮小是細胞遷移和細胞繁殖共同作用的結果,而不是單純的細胞遷移。如果你要單純的考慮細胞遷移,你可以先用絲裂霉素(1 μg/ml)處理一小時,抑制細胞的分裂,這樣你的結果就是細胞遷移的作用了。另外,使用無血清培養基也可以降低增殖對實驗結果的影響。

6) 照片拍完之后,可以用imageJ 來測量劃痕區域的像素定量比較細胞遷移的速度。

7) 雖然無血清培養可以忽略細胞增殖的影響,但是由于細胞內信號傳導系統整體性的下調節,細胞遷移的速度也會慢很多。

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