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實驗技術交流

細胞侵襲方法:Transwell侵襲實驗原理步驟詳解

文字:[大][中][小] 手機頁面二維碼 2019/8/27     瀏覽次數:    
今天主要介紹常用的細胞侵襲方法:Transwell侵襲實驗的原理和步驟方法。和細胞劃痕實驗相比Transwell實驗相對復雜一些,在實驗過程中往往會出現各種問題,下面我們就一起來探討下transwell侵襲實驗中需要注意的一些細節!

首先我們來看下圖腫瘤細胞轉移的5個主要過程,以便于對腫瘤侵襲和轉移有個更加清晰的認識。

腫瘤細胞轉移過程

腫瘤細胞轉移過程


其中細胞侵襲便發生在第一步,即腫瘤細胞在原位突破基底膜,然后內滲進入血管、淋巴管的過程,后期才開始進行轉移。本期我們就為大家講述利用transwell小室模擬細胞侵襲的實驗方法。


Transwell侵襲實驗的原理和過程

transwell原理簡單來說,將transwell小室放入培養板中,并將高營養液與低營養液用一層膜隔開,細胞放在低營養液中,而為了獲更多的營養,細胞則會穿過這層膜,進入高營養液。細胞transwell實驗,可作為一種非常簡便的研究腫瘤細胞遷移、侵襲以及轉移情況的方法。transwell小室的結構示意圖如下左圖;

下右圖為利用血清為誘導因子,模擬腫瘤細胞侵襲的過程。簡單來說即:膜可以將上下室的營養液隔開,如下室常為有血清培養基。這樣細胞放無血清的培養基里,為了吃的更好會往下跑,但是有膜擋著,所以要穿過膜才行。此時膜上涂一層基質膠,就可模仿細胞外基質,細胞必須要把基質消化了才可跑到下室,最后計算下室的細胞量即可反應細胞的侵襲能力。


transwell小室結構示意圖橫機紋肉瘤細胞侵襲示意圖

Transwell侵襲實驗的具體步驟

一、實驗材料(提前1天準備)

a)Transwell小室

b)基質膠:常用的是人工重構基底膜材料Matrigel,需要提前12h將Matrigel膠從-20℃取出于4℃冰箱過夜。因其4℃時是液體,在 37℃會逐漸凝固成膠狀,且不可逆。它能在培養基中重建形成膜結構,這種膜結構與天然基質膜結構極為相似。如果購買的小室是已經鋪好基質膠的,那么Matrigel就不需要購買了;

c)上層培養液:上層培養液采用無血清培養基,為維持滲透壓,可以加入0.05%-0.2%BSA;

d)下層培養液:下層培養液采用含5%-10%FBS的培養基,具體濃度根據細胞轉移力而定,轉移力弱的細胞可適當提高FBS濃度。下層也可用趨化因子“引誘”細胞轉移,如將纖維粘連蛋白加入下層培養液作為趨化因子;

e)細胞培養板:常用6孔板、12孔板、24孔板等。其中,以24孔板最常用,下面就以24孔板為例。


二、操作步驟

1.鋪基質膠:在4℃條件下將Matrigel膠用無血清的細胞培養基或PBS緩沖液按照1:8比例稀釋(其稀釋比例需要摸索,選擇一個細胞穿過適中的濃度即可),取100μl均勻涂抹于上室的聚碳酸酯膜表面,37℃放置0.5-1h,使其聚合成凝膠;

Tips:
a) 將槍頭沿小室內壁將Matrigel輕輕打出,切忌戳到小室濾膜;
b) 加入的Matrigel膠的體積不可太大,把聚碳酸酯膜浸濕即可;
c) 注意低溫,槍頭、小室等都應該4℃預冷。


2.細胞培養:取對數生長期的待測細胞,并用PBS洗滌,接著用無血清培養基懸浮細胞,調整細胞密度為1-10*105/ml;


3.接種細胞:在24孔板下室一般加入500-650 μL 含 5%-10%FBS 或趨化因子的培養基,然后用鑷子將Transwell小室置于24孔板內,取細胞懸液100-200μL 加入上室,最后放入培養箱中培養12-48h(根據癌細胞的轉移能力而定)。

Tips:

a) 盡量避免氣泡的產生:下層培養液和小室間常會有氣泡產生,會影響下層培養液的趨化作用。因此一旦出現大氣泡,要將小室提起,去除氣泡,再將小室放進培養板;

b) 注意細胞一定要接種均勻,建議沿著壁緩慢加入;

c) 時間點的選擇除了要考慮到細胞的轉移能力以外,處理因素對細胞數目的影響也不可忽視,如某些藥物會抑制細胞的增殖。


4.細胞固定:取出小室,吸走培養基,用棉簽輕輕擦拭Matrigel和上室內的細胞。取新的24孔板加入4%多聚甲醛600μL,將小室放入后固定20-30min。


5.細胞染色及計數:棄固定液,用0.1-%0.2%結晶紫染色5-10min,PBS洗3遍,除去未與細胞結合的結晶紫,用棉簽輕輕擦拭小室的上側,將非特異性結合于小室上表面的染料擦掉,以便后續鏡檢。適當風干后,在高倍顯微鏡下選取5個視野觀察細胞并計數。

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