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實驗技術交流

4種Transwell實驗的步驟

文字:[大][中][小] 手機頁面二維碼 2019/8/28     瀏覽次數:    
本文主要介紹4種Transwell實驗的實驗步驟,具體包括:Transwell腫瘤細胞遷移實驗、Transwell上皮細胞培養實驗、Transwell B16細胞的體外遷移實驗、Transwell內皮細胞HMEC-1遷移實驗


一、Transwell腫瘤細胞遷移實驗

過程與Transwell侵襲實驗基本一致,不同的只是不需要鋪Matrigel。由于沒有基質膠的阻擋,細胞穿過膜的速度較侵襲實驗明顯加快,所以細胞量要更大。我做侵襲實驗的細胞密度是1×105,而遷移實驗的密度是1×106。另外,下層培養液的FBS濃度也可適當下調,侵襲實驗的濃度是5%,遷移實驗的濃度是2.5%。



二、Transwell上皮細胞培養
1. 將雄性wistar大鼠麻醉,開胸,將氣管取出,置于4℃含0.1%胰蛋白酶XIV、100 U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素、無Ca2+、無Mg2+、無血清的MEM。
2. 用無菌的細胞刮棒刮氣管內壁,將所得溶液離心后得到游離細胞。
3. 離心后立即用新鮮的上述MEM溶液(含10%胎牛血清)清洗3次,以中和胰蛋白酶,再用含5%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的LHC-8 medium沖洗一次。
4. 沖洗過后,將得到的細胞懸液用臺盼蘭測定活力,若存活率大于90%,則將細胞以106/cm2密度接種于可通透的多聚碳濾膜上(12mm),以37°C,5%CO?-95%空氣,含5%胎牛血清,100 U/mL青霉素,100μg/mL鏈霉素的LHC-8 medium孵育6~10天。
5. 孵育后,經測定跨上皮電阻在1000~2000Ω之間,即可用于電生理試驗。顯微鏡下氣管上皮細胞形細胞呈鋪路石狀,圓形核位于中央,生長時常彼此緊密連接成單層細胞片。



三、Transwell B16細胞的體外遷移實驗

首先把Transwell倒置,在Transwell的PVPF膜(0.8μm)的下表面涂一層fibronectin(10 μg/mL,50μL),37度2小時,PBS洗一遍后,放入預先每孔加有600μL的培養基(含10%血清)的24孔板內,后在Transwell的內室加入細胞(100μL,用含0.1%血清的培養基稀釋好自己所需密度),放入培養箱,12-18小時后,取出Transwell,用棉簽擦去PVPF膜靠近內室那一面的細胞,另一面的細胞用甲醛室溫固定30分鐘,結晶紫染色20分鐘,用清水洗3遍以上,后在顯微鏡下觀察細胞,記數。


四、內皮細胞HMEC-1遷移實驗
1%明膠處理的Transwell經無血清的MCDB131培液于培養箱中平衡1小時后,上室加入100μL用serum-free MCDB131稀釋的5×10?/孔的HMEC及不同濃度的藥物,下室加入0.6mL serum-free的MCDB131培液及20%FCS刺激遷移,同時設置相應陰性及陽性對照,置于CO?培養箱中作用8小時,然后棄去孔中培液,用90%酒精常溫固定30分鐘,0.1%結晶紫常溫染色10分鐘,清水漂凈,用棉簽輕輕擦掉上層未遷移細胞,顯微鏡下觀察并拍照,最后用10%乙酸100μL/孔抽提10分鐘,于600nm處測定OD值。抑制率計算公式為:抑制率(%)=[(OD值給藥組-OD值無刺激陰性對照)/(OD值不加藥陽性對照-OD值無刺激陰性對照)]×100%。


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