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實驗技術交流

Western Blot實驗詳解:從原理和步驟說起

文字:[大][中][小] 手機頁面二維碼 2019-9-8     瀏覽次數:    

Western Blot(WB)是一項很基礎的實驗,但卻是很多同學心中的痛,對于基礎的WB實驗,我們必須掌握,下面我就從原理和步驟說起教大家如何做Western Blot實驗。當然,沒時間做實驗的同學也可以選擇Western Blot服務


Western Blot實驗原理

Western Blot是一種非常經典的定性、定量檢測蛋白表達的方法。其原理通俗來說:采用聚丙烯酰胺凝膠電泳,蛋白質是被檢測物,“探針”是抗體,“顯色”用標記的二抗。經過PAGE分離的蛋白質樣品,轉移到固相載體(例如硝酸纖維素薄膜)上,固相載體以非共價鍵形式吸附蛋白質,且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學活性不變。以固相載體上的蛋白質或多肽作為抗原,與對應的抗體起免疫反應,再與酶或同位素標記的第二抗體起反應,經過底物顯色或放射自顯影以檢測電泳分離的特異性目的基因表達的蛋白成分。



Western Blot實驗步驟

1. 蛋白樣品提取

既然是測蛋白,那么我們首先要做的自然就是提取蛋白。可按如下步驟進行:


a) 若樣品為細胞樣品,而且是貼壁細胞(細胞數量一般保證在1×106~1×107)然后用預冷的PBS洗2~3次,之后加入含PMFS的強RIPA裂解液(約300ul),將細胞刮下,儲存在離心管中;若為懸浮細胞,則先離心,去除上層培養液,再用預冷的PBS重懸,離心,重復操作2~3次,之后再加入RIPA裂解液,儲存在離心管中;


b) 若樣品為動物組織,我們先可以取適量(250~500mg)新鮮組織樣品或正確保存的組織樣品,加1ml含PMFS的強RIPA裂解液,用電動勻漿器進行破碎勻漿;


c) 不管是哪一類型的樣本,這一步就要將加入裂解液后收集的樣品,置冰上,裂解20~30min;

Tips:中間可以顛倒混勻數次,主要需要裂解完全


d) 接下來就是離心,我們選擇4℃,12000轉,離心10min;

Tips:離心機可以提前預冷至4℃


e) 最后,在離心后取上清,即為提取的總蛋白。


2. 蛋白濃度測定

蛋白提取出來了,現在我們來測定蛋白濃度,按照BCA法測定蛋白濃度。方法如下:


1.取1.2ml蛋白標準配制液加入到一管蛋白標準(30mg BSA)中,充分溶解后配制成25mg/ml的蛋白標準溶液。配制后可立即使用,也可以-20℃長期保存。


2.取適量25mg/ml蛋白標準,稀釋至終濃度為0.5mg/ml。例如取20μl25mg/ml蛋白標準,加入980μl稀釋液即可配制成0.5mg/ml蛋白標準。蛋白樣品在什么溶液中,標準品也宜用什么溶液稀釋。但是為了簡便起見,也可以用0.9%NaCl或PBS稀釋標準品。稀釋后的0.5mg/ml蛋白標準也可以-20℃長期保存。


3.根據樣品數量,按50體積BCA試劑A加1體積BCA試劑B(50:1)配制適量BCA工作液,充分混勻。例如5mlBCA試劑A加100μlBCA試劑B混勻,配制成5.1mlBCA工作液。BCA工作液室溫24小時內穩定。


4.將標準品按0, 1, 2, 4, 8,12, 16, 20μl加到96孔板的標準品孔中,加標準品稀釋液補足到20ul。


5.加適當體積樣品到96孔板的樣品孔中,加標準品稀釋液到20μl。


6.各孔加入200μl BCA工作液,37℃放置20-30分鐘。


(注:也可以室溫放置2小時,或60℃放置30分鐘。BCA法測定蛋白濃度時,顏色會隨著時間的延長不斷加深。并且顯色反應會因溫度升高而加快。如果濃度較低,適合在較高溫度孵育,或適當延長孵育時間)


7.測定A562nm波長,540-595nm之間的波長也可接受。根據標準曲線計算出樣品的蛋白濃度。


3. 電泳

前面的工作做完了,終于到了實驗的重頭戲:電泳。電泳時需要設計好加樣順序,做好實驗記錄,按照預定順序加樣。我們來看一下具體操作流程。


1)清洗玻璃板


蘸點洗潔精輕輕擦洗。兩面都擦洗過后用自來水沖,再用蒸餾水沖洗干凈后立在筐里晾干。若不繼續使用,需用無水乙醇擦拭后晾干再妥善收起來,玻璃板之間墊玻璃紙隔開。梳子應用水洗干凈,臨用前用無水乙醇擦拭晾干。


2)灌膠與上樣


① 玻璃板對齊后放入夾中卡緊。然后垂直卡在架子上準備灌膠(操作前先往玻璃板間灌水,檢查是否漏)。

② 按配膠試劑盒說明書選擇合適的分離膠濃度配置,最后加入 TEMED,之后搖勻即可灌膠。配制凝膠時要充分混勻,此外應保證試劑的新鮮,特別是過硫酸銨。


灌膠時掌握好速度,避免氣泡產生(注意濃度越小的膠含水越多,凝固后膠體積縮小越多)。然后膠上加一層水,液封后的膠凝的更快(灌膠時開始可快一些,膠面快到所需高度時要放慢速度。操作時膠一定要沿玻璃板流下,這樣膠中才不會有氣泡。加水液封時要很慢,否則膠會被沖變形)。

未聚合的丙烯酰胺具有神經毒性,操作時應該戴手套防護。梳子插入濃縮膠時,應確保沒有氣泡。注意給積層膠留出足夠的空間(分子克隆推薦長度為插入的梳齒長再加 1 cm)。


③ 當水和膠之間有一條折射線時,說明膠已凝了。再等幾分鐘覺得差不多的時候就可倒去膠上層水并用吸水紙將水吸干。聚合時間由 AP 以及 TEMED 決定,通常在 30 min 左右,AP 不新鮮會導致聚合變慢,氣溫較低時膠是會凝得慢一些,必要時可適當增加 AP 以及 TEMED 的量,但通常不會超過 1 h,若超過 1 h 甚至更長仍未聚合,應檢查配制的操作有無錯誤。


由于 TEMED 催化 APS 釋放相關化學基團,再由 APS 釋放的基團催化 Acr/Bis 聚合,所以如果 APS 不新鮮的話加再多的 TEMED 效果也不佳,這就是為什么推薦 APS 每周新鮮配置的原因。


④ 按說明書配積層膠,加入 TEMED 后立即搖勻即可灌膠。將剩余空間灌滿濃縮膠然后將梳子插入濃縮膠中。灌膠時也要使膠沿玻璃板流下以免膠中有氣泡產生。插梳子時要使梳子保持水平。


由于膠凝固時體積會收縮減小,從而使加樣孔的上樣體積減小,所以在濃縮膠凝固前最好在兩邊補膠至剛剛冒頂。待到濃縮膠凝固后,兩手分別捏住梳子的兩邊豎直向上輕輕將其拔出。


⑤ 趁積層膠聚合的這段時間,取適當體積樣本混合 1X SDS loading buffer(最好事前分裝好,每次從冰箱里取一管即可),95~100° 加熱 5 min,若有沉淀可用稍低溫度,比如 45~55° 加熱 1 h 達到變性的目的。我一般習慣分裝 20 ul 到 PCR 管里,先和 loading buffer 混合好,臨用前用 PCR 儀加熱 95 °C 5 min,效果不錯。


⑥ 膠做好后連同玻璃板一起安裝到電泳槽上,加入電泳緩沖液后開始準備上樣。加樣前可用 5 ml 注射器或加樣器先沖洗一下加樣孔。用微量加樣器貼壁吸取樣品,將樣品吸出不要吸進氣泡。將加樣器針頭插至加樣孔中緩慢加入樣品(加樣太快可使樣品沖出加樣孔,若有氣泡也可能使樣品溢出。加入下一個樣品時,進樣器需在外槽電泳緩沖液中洗滌 3 次,以免交叉污染。


目前我們做的 mini 膠上有 10 個上樣孔,一般在第一個孔加入 marker(我用的是 Fermentas 預染 marker),其余 9 個孔加入樣品,也可在頭尾孔內加入 marker,中間 8 個孔加樣品。加樣前樣品應先離心,尤其是長時間放置的樣品。在未加樣的孔中應加入等量的樣品緩沖液。上樣時,小心不要使樣品溢出而污染相臨加樣孔。也可使用 10 ul 的槍頭就行,比用微量加樣器快很多,用槍頭時注意不要插得太深,容易把玻璃板撐開,樣品就落到膠和玻璃板之間的空隙了。


3)電泳

電泳槽內加入電泳緩沖液沖洗清除黏附在凝膠底部的氣和未聚合的丙烯酰胺,網上有資料建議低電壓短時間的預電泳,清除凝膠內的雜質,疏通凝膠孔徑以保證電泳過程中電泳的暢通,但是在《分子克隆》上卻反對這種做法,理由是會破壞緩沖系統 pH 的不連續性。

Tips:其實大家按照實際經驗來做即可。電泳時間和電壓說法各異。按照各實驗室的慣例或者電泳槽的使用說明來操作。

電泳至溴酚蘭剛跑出即可終止電泳,進行轉膜。為減少蛋白質條帶的擴散,上樣后應盡快進行電泳,電泳結束后也應直接或者轉印。


4. 轉膜(Transfer)


在跑膠時就可以準備轉膜用品,最主要趕氣泡。我們實驗室使用的是半干轉膜電泳槽。對于轉印 90 kd 以下的蛋白,轉膜液都不用加 SDS,如果是蛋白分子量大的話可以加入 0.037% 的 SDS。


1)剪PVDF膜,并提前切個角,甲醇中泡30s。


2)將膜、海綿、濾紙一起泡入1*轉膜液中保存。

Tips:轉膜液可回收。


3):將夾子打開使黑的一面保持水平。在上面墊一張海綿墊,用玻璃棒來回搟幾遍以搟走里面的氣泡。(一手搟另一手要壓住墊子使其不能隨便移動。)在墊子上墊2層濾紙,一手固定濾紙一手用玻棒搟去其中的氣泡。將膠蓋于濾紙上,輕輕用玻棒搟去氣泡。將膜用鑷子蓋于膠上,并除氣泡。在膜上蓋2層濾紙并除去氣泡。最后蓋上另一個海綿墊,合起夾子。

Tips:整個操作在1*轉膜液中進行,要不斷的搟去氣泡。膜兩邊的濾紙不能相互接觸,接觸后會發生短路。


4)將夾子放入轉膜槽槽中,黑對黑,紅對紅。電轉移時會產熱,過熱有可能造成蛋白質的降解,同時大量產熱,會使凝膠膨脹,有可能在膠和膜之間產生空隙,引起轉膜不均勻,所以在轉膜槽外放冰盒,在冰水混合物中進行轉膜。

Tips:轉膜條件是電流200mA或電壓110V,2h;另一個約束條件就是電壓必須控制在60-70V,調節電流。


5)轉完后將膜放入裝水的小盒中沖洗,倒水后,加5%的封閉液,搖床封閉2h。 防止產生高背景信號,封閉是利用利用脫脂奶粉或 BSA。


5. 免疫反應及數據分析


1)回收封閉液,加入一抗,搖床4℃過夜。


2)一抗孵育。配置特定濃度的一抗稀釋液,與膜進行孵育, 一抗會與膜上目的蛋白進行特異性結合。


3)一抗孵育結束后,與特定濃度的二抗進行孵育結合。二抗帶 HRP或 AP標記。


4)二抗回收,用PBST洗,洗5次,每次5min。(少時多次)


5)化學發光顯影,曝光/成像。純水沖洗5-7次,倒掉純水,加化學發光,膜在化學發光中浸泡2-3min,成像。曝光成像后,將膠片進行掃描或拍照,用凝膠圖象處理系統分析目標帶的分子量和凈光密度值。

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