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實驗技術交流

想做好細胞免疫熒光實驗?這4個關鍵你必須掌握!

文字:[大][中][小] 手機頁面二維碼 2019-9-17     瀏覽次數:    

細胞免疫熒光實驗在很多文章里必不可少,而好的實驗結果更有助于文章的發表,那么如何才能做好細胞免疫熒光實驗呢?今天主要從4個方面來和大家分享一下細胞免疫熒光實驗的經驗和技巧。


1.細胞密度

細胞密度是整個實驗是否能成功的關鍵點之一。無論是貼壁細胞還是懸浮細胞,爬片后細胞密度直接影響到后續的熒光拍照效果。
免疫熒光對細胞密度的要求不同于細胞劃痕實驗。我們在做細胞劃痕的時候,一定要等到細胞長滿才可以進行后續操作,但是免疫熒光并不需要這么多的細胞數量,鏡下細胞太多反而會讓圖像效果很亂,沒有針對性;如果細胞數量太多,產生疊加,也會影響整體熒光效果。

四周細胞較多,中間少 20倍鏡下DAPI核染色

左(一)可能不是很清楚,玻片四周的細胞較多,中間的細胞較少。右(一)20倍鏡下DAPI核染色可見細胞密度較大,其中亮度更顯著的地方很可能是多層細胞疊加的效果。


那么我們該如何控制好細胞爬片時的密度呢?我們需要考慮的到爬片的尺寸和細胞生長時間。爬片是一個動詞,其實就是將玻片放到培養皿中,讓細胞在玻片上生長。


第一點:保證玻片上的細胞以單層細胞生長

在這一點上,個人認為懸浮細胞很容易被吹打混勻,玻片上的細胞基本上可以保證處于同一層面。但是貼壁細胞本身很喜歡抱團生長,所以鏡下總是一簇一簇的細胞聚集,這種情況下就很難保證細胞生長同一層面了。那么我們在做這一步的時候,建議大家用10μl的小槍頭吸取細胞懸液,在25mm的細爬片上從玻片外圈向內圈轉圈加樣(見下圖),這么做相當于在緩慢加樣的過程中,玻片上的細胞又完成了一次從外向內和從內向外的混勻過程,防止某一部位的細胞聚集。

轉圈加樣示意圖

加樣結束后,鏡下觀察細胞初步密度。如果細胞密度過大,可以將玻片上的細胞懸液吸回再重新稀釋;如果細胞密度可以,只是還存在部分細胞聚集,可以用5ml的注射器針頭輕輕撥動細胞懸液,注射器針頭相對于10μl的槍頭還是細的,不會破壞細胞形態。


第二點:細胞生長速度

細胞生長速度也是我們需要考慮的一個因素。正常細胞放在6cm的培養皿中,可能2-3天才會長滿。但是爬片的面積本身較小,細胞在小面積的爬片上生長速度會更快一些,所以一般等到爬片上的細胞穩定后,再添加培養基于孵箱內培養12小時就可以了。如果時間超過24小時,即使最開始接種密度小,最后也會長得很滿。


第三點:保證爬片是無菌的

從公司購買的爬片都是經過γ射線滅菌后用錫紙包裝的,是可以直接使用的。使用之前在超凈臺下照一下紫外就可以了。然而實驗中我們會發現,放置時間較長的爬片會經常黏連,很難分開。造成這種情況的原因多半是之前使用過的人沒有把爬片封存好,接觸到空氣后,濕度較大造成的爬片黏連。我們在分離爬片的時候最好選用塑料材質的鑷子(轉膜時常用的那種材質),這樣的鑷子較軟,一般不會將爬片捏碎。每次使用后記得用錫紙包裹好放回專門保存爬片的盒子中。其實只要保證使用后包裹嚴密,就不會造成黏連的情況。



2.孵育抗體

值得一提的是細胞免疫熒光的抗體和WB的抗體并不都是能通用的。要看具體的購買廠家的說明書。一抗二抗的孵育條件和Western blot實驗中大致相同,可以選擇室溫、4℃和37℃孵育一抗。不過大多數人還是習慣于4℃放置濕盒內孵育過夜,抗原抗體緩慢結合可以避免非特異性染色。但是如果選擇4℃孵育過夜,一定要先恢復至室溫后再用PBS清洗一抗,如果馬上清洗很容易造成脫片。


我們在做WB的時候,首次會選擇這個抗體的最高濃度去孵育,以便能發出清晰的條帶。但是在做IF的時候,如果抗體的濃度過高,會讓后續圖像曝光效果過亮或者熒光定位有偏差,所以建議大家首次做IF時,可以根據抗體說明書選擇一個中間濃度孵育。

免疫熒光圖片



如上圖所示的免疫熒光圖片,看似結果很漂亮。可是實際上我們要檢測的蛋白是一個細胞膜標志性蛋白,但是圖中的效果似乎胞質和細胞核染色更為明顯。遇到這種似乎是目的蛋白定位偏差的情況,可能的原因:

1.一抗濃度過高;

2.一抗孵育之后洗滌不充分;

3.一抗特異性不高,這時候你要考慮這個蛋白是細胞本身就表達的還是轉入的質粒表達的;

4.可以查一下抗體識別序列,看看是否有同源性的蛋白。

就像跑WB的時候,某些蛋白總是會跑出兩條條帶一樣,可能你這個目的蛋白的某個同源性蛋白會結合細胞的其他部位,雖然廠家在生產抗體的時候一般不會有這種問題,但是如果修改了實驗步驟的所有條件后,仍然定位不準確,你可以考慮一下第3/4兩點。


二抗室溫孵育1小時就可以了。注意封閉液和一抗是可以回收的,二抗是不能重復利用的。

 重復利用二抗的錯誤示例

二抗重復利用



3.DAPI復染細胞核
建議DAPI現用現配,而且不用染色太長時間。如果你的試劑是新配制的,避光復染2-3分鐘就足夠了。用PBS清洗玻片的時候,也建議在避光環境下清洗。因為DAPI本身發藍光,如果藍光太強,熒光顯微鏡會將藍光顯示成綠光,影響結果分析。

DAPI復染細胞核示例



4.封片

滴加封片劑的時候,要將有細胞的一面朝下放置。可以選擇抗熒光淬滅的封片劑也可以選擇甘油封片。日常實驗中,如果你不需要等很長時間才可以觀察結果,或者不需要后續重復觀察,也可以不用封片,立即鏡檢。

滴加封片劑的時候只需要在載玻片的中心位置滴加一滴就好,差不多5μl左右的量就可以了。然后把有細胞的面朝下貼在載玻片上,注意不要產生氣泡。

如果封片劑滴加過多,那你的細胞熒光就會被完全覆蓋住,什么都看不到了。



細胞免疫熒光關鍵總結

1.清楚蛋白定位和預測蛋白表達;

2.細胞爬片時的密度;

3.一抗濃度和特異性好壞;

4.涉及到雙標染色,切記要將兩種蛋白的種屬來源區分開,二抗的顏色也要區分開;

5.DAPI復染時間;

6.細胞免疫熒光最好不封片,新手很容易在最后一步功虧一簣;

7.如果要觀察時間梯度的變化,盡量不用一次性觀察好幾個時間組,一次只觀察1-2組,不會影響熒光效果。

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